Studio sulla relazione tra la resistenza alla kanamicina ed il gene “Putative aminoglycoside 3’-phosphotranferase (PAPH) in Sinorhizobium meliloti ceppo 1021

Abstract

Il ceppo selvatico di Sinorhizobium meliloti 1021 è sensibile alla kanamicina (30 mg/l) anche se Capela et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(2001), 98: 9877-9882), analizzando l’intero genoma, hanno trovato un gene codificante per una “putative aminoglycoside 3'-phosphotransferase” (PAPH), coinvolta nella resistenza ad antibiotici aminoglicosidici quali la kanamicina. Un mutante spontaneo (GM42) kanamicina resistente (200 mg/l) di Sinorhizobium meliloti 1021 è stato caratterizzato da un punto di vista molecolare e fenotipico per analizzare l’attività del gene PAPH. Il ceppo parentale e GM42 sono stati caratterizzati da un punto di vista microbiologico tramite il MicroLog System Biolog. I risultati mostrano pattern differenti tra il ceppo parentale ed il mutante sulla base della loro capacità di utilizzare o meno fonti di carbonio quali mannitolo o maltosio. L'amplificazione del gene PAPH tramite PCR ha prodotto un'unica banda sia nel ceppo wild-type 1021 che in GM42 e dal loro sequenziamento non è emersa alcuna differenza nucleotidica. Tuttavia, l’analisi trascrizionale mediante RT-PCR del gene PAPH ha evidenziato differenze tra i due ceppi. Infatti il wild-type non ha prodotto alcun amplicone, mentre GM42 esprime il gene PAPH in diverse condizioni di crescita saggiate. Sono state condotte ulteriori analisi mediante Western blotting sulle proteine totali del parentale e del ceppo mutante utilizzando l’anticorpo anti-neomicina fosfotransferasi II. GM42 contiene un peptide che immunoreagisce con l’anticorpo utilizzato, tale reattività è assente nel ceppo selvatico. Inoltre tale gene è stato clonato nel vettore di espressione pKK223-3 in E. coli TOP10 e i cloni ottenuti hanno acquisito resistenza alla kanamicina. Dal confronto dell’espressione genica effettuata mediante DNA-microarrays si evidenzia un’overespressione del gene PAPH e della regione a monte di tale gene nel mutante kanamicina resistente. Saranno condotte ulteriori indagini per la comprensione dei meccanismi genetici alla base del fenotipo del ceppo mutante GM42. Ciò rappresenterà un considerevole passo in avanti nello studio dei fattori di resistenza delle popolazioni naturali di S. meliloti 1021, aprendo la strada ad un razionale impiego in agricoltura sostenibile.