Miscele di k-carragenina e PVA come bio-inchiostri per stampa 3D di scaffold per la ricostruzione della cartilagine

Abstract

Introduzione La k-carragenina (kC) è un poligalattano solfato ottenuto da alghe rosse con un contenuto di estere-solfato dal 25 al 30% e una peso molecolare medio ben superiore a 100 kDa. È formato da unità alternate di D-galattosio e 3,6-anidro-galattosio (3,6-AG) unite da legami α-1,3 e β-1,4-glicosidici. [1] Il kC assomiglia ai glicosaminoglicani (GAG) che sono i costituenti centrali dei tessuti connettivi, può essere quindi studiato per produrre scaffold per l'ingegneria tissutale. Il kC è solubile in acqua a temperature superiori a 60 °C e può formare gel stabili raffreddandosi. Le reti di kC sono forti, fragili e l'assenza di porosità interconnesse può limitare la colonizzazione dell'impalcatura da parte delle cellule e l'accesso di nutrienti e ossigeno. Le miscele di kC con altri polimeri più resistenti, come l'alcol polivinilico (PVA), possono migliorarne le proprietà meccaniche e creare porosità.[2] Gli idrogeli sono spesso usati come bio-inchiostri per i processi di stampa 3D che mirano a ricostruire la matrice extracellulare di tessuti relativamente molli. La possibilità di stampare parti del corpo danneggiate o mancanti sulla base di un disegno assistito da computer (CAD) promette la realizzazione di strutture specifiche per il paziente. [3] Le proprietà fisico-chimiche e biologiche dell'idrogelo devono essere armonizzate con il comportamento viscoelastico della formulazione durante e dopo l'estrusione dall'ugello di stampa. Gli idrogel reticolati fisicamente sono spesso preferiti rispetto ai sistemi reticolati chimicamente perché non richiedono la presenza di iniziatori e catalizzatori, che potrebbero indurre citotossicità e richiedere una purificazione accurata. Il nostro studio esplora l'idoneità dei sistemi acquosi di kC/PVA con tre diversi rapporti di peso tra i due polimeri per la stampa 3D di scaffold per la ricostruzione della cartilagine. Materiali e metodi Ingredienti k-carragenina (kC) fornita Gelcarin ME 8625 FMC; polvere di alcol polivinilico (PVA), con peso molecolare di 146000-186000 e grado di idrolisi del 99+% fornita da Sigma-Aldrich; mezzo di coltura per sferoidi di cellule staminali (SCM); terreno di coltura StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit (CDM). Procedura Le soluzioni di PVA/kC sono state preparate alle seguenti composizioni: PVA 2%w e kC 4%w, PVA 3%w e kC 3%w, PVA 4%w e kC 2%w. Le soluzioni sono state fatte raffreddare a temperatura ambiente per una notte (FT0). Sono poi stati eseguiti cicli di congelamento-scongelamento (FT) per reticolare fisicamente il PVA, congelando gli idrogeli per 2 ore e scongelandoli per 2 ore due volte al giorno per un giorno (FT1) e per cinque giorni consecutivi (FT5). La spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a riflettanza totale attenuata (ATR-FTIR) dei campioni liofilizzati è stata condotta con uno spettrofotometro Perkin-Elmer Spectrum Two accumulando 32 scansioni tra 4000-400 cm-1, con una risoluzione di 4 cm-1. Le analisi reologiche sono state eseguite utilizzando un reometro AR G2 (TA Instruments): a 90 °C per le misure di viscosità; a 37 °C, nell'intervallo di frequenza 0.1-10 Hz e con uno strain di circa 8x10-4 per le misure dinamico-meccaniche in frequenza; a 1 Hz, variando la temperatura da 90 °C a 25 °C a 1 °C/min e 10 °C/min e con uno strain di 5×10-4 per le misure a scansione in temperatura (T). Le indagini morfologiche sono state condotte con un microscopio a scansione elettronica (SEM) a 10kV su idrogeli liofilizzati. I test di rigonfiamento ed erosione in PBS sono stati eseguiti attraverso misure gravimetriche dopo incubazione a 37 °C per intervalli di tempo prestabiliti. Le prove meccaniche a compressione stress-strain sono state eseguite con un Instron 3365. Le prove di stampabilità 3D sono state eseguite con una stampante Dr ROKIT Invivo. I test di vitalità MTS delle SASCs negli idrogeli sono stati eseguiti a 21 giorni in presenza del terreno SCM e in condizion