Analisi degli effetti del Cetuximab in linee cellulari di adenocarcinoma colorettale

Abstract

Il carcinoma del colon-retto (CRC) è una malattia eterogenea, che si sviluppa in seguito a numerose alterazioni genetiche ed epigenetiche. Una famiglia genica che si trova frequentemente mutata nei tumori è quella di ras che consta di tre principali protoncogeni (H-, K- e N-Ras) localizzati su cromosomi differenti e codificanti proteine G del peso di 21 KDa. Il 50% dei casi di CRC presenta mutazioni puntiformi missense a carico del gene KRAS, il 90% delle quali si verifica a livello dei codoni 12 e 13 e rende la proteina costitutivamente attiva. Diversi studi dimostrano come mutazioni di differenti codoni di K-Ras potrebbero avere diverse conseguenze biologiche e determinare una diversa risposta ai trattamenti farmacologici. Negli ultimi anni sono state sviluppate diverse terapie per il trattamento del CRC, tra i nuovi farmaci vi è il Cetuximab, un anticorpo monoclonale IgG1 chimerico uomo/topo, che agisce contro il dominio extracellulare dell’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Il legame di questo anticorpo al recettore comporta una diretta inibizione della sua attività tirosin-chinasica provocando il blocco della trasduzione del segnale mediato da pathways quali quello di PI3K/AKT, e di RAS-RAF/MAPKs, inducendo quindi meccanismi proapoptotici e blocco della proliferazione cellulare. Numerosi trials clinici condotti negli ultimi anni hanno dimostrato che i pazienti con CRC che hanno mutazioni in K-RAS nel codone 12 o 13 rappresentano una popolazione eterogenea nella risposta al trattamento con il Cetuximab e sono attualmente esclusi dal trattamento con tale farmaco. Per valutare come cellule con mutazioni differenti rispondano a trattamenti con Cetuximab, nel nostro laboratorio abbiamo iniziato a condurre esperimenti sulla linea cellulare di CRC HT-29 caratterizzata da mutazioni nei geni BRAF e PIK3CA, e dotata di KRAS wild type, e su due cloni di HT-29 stabilmente trasfettati con i cDNA codificanti per K-RasG12V e K-RasG13D posti sotto il controllo di un promotore inducibile dall’ormone Mifepristone [GeneSwitchTM System (Invitrogen)]. Le diverse linee cellulari sono state sottoposte a trattamento con diverse concentrazioni di Cetuximab ed è stata valutata la proliferazione cellulare dopo 24, 48 e 72 ore di trattamento. Dai primi risultati ottenuti sembra che le cellule con la mutazione K-RASG13D siano parzialmente sensibili al trattamento con Cetuximab mostrando un’alterazione nel tasso di proliferazione cellulare mentre le cellule parentali HT29 e il clone K-RASG12V sembrano non risentire di alcun effetto qualunque sia la concentrazione di farmaco utilizzata. Questi primi risultati seppure da confermare e supportare con ulteriori indagini biomolecolari sembrano avvalorare l’ipotesi secondo cui tumori caratterizzati da mutazioni differenti rispondono in maniera differente alle terapie oggi in uso.