Effetti dell'espressione di K-RasG12V e K-RasG13D in cellule di adenocarcinoma colorettale HT29

Abstract

RAS è una piccola proteina di 21kDa che si trova frequentemente mutata nei tumori. La famiglia dei geni ras consta di tre principali protoncogeni chiamati H-, K- e N-Ras. Le tre isoforme di Ras regolano la proliferazione, il differenziamento e la morte cellulare mediante l’attivazione di diversi pathways di trasduzione del segnale fra cui la cascata delle MAP chinasi e il pathway di PI3K/AKT. Le diverse isoforme di Ras attivano tutte gli stessi pathways, ma con diversa efficienza, e ciò potrebbe essere, almeno in parte, una conseguenza delle loro differenti modifiche post-traduzionali che determinano la localizzazione in specifici microdomini della membrana plasmatica. Diversi studi hanno dimostrato come l’incidenza di mutazioni dei geni ras varia tra i diversi tipi tumorali ed è stata riscontrata una certa correlazione tra il tipo di tumore e l’isoforma di Ras mutata. K-Ras si trova più frequentemente mutato nel carcinoma colorettale e le alterazioni sono per il 90% mutazioni puntiformi nel codone 12 o 13 e raramente nel codone 61. I residui aminoacidici che corrispondono nella proteina a questi codoni sporgono nel sito catalitico e sono importanti per l’attività GTPasica, quindi mutazioni in questi siti rendendo Ras iperattiva. Molti studi riportano che in differenti tumori primari o metastatici mutazioni di differenti codoni, o differenti mutazioni nello stesso codone e mutazioni in isoforme diverse di Ras potrebbero avere conseguenze biologiche diverse. Per comprendere le basi molecolari dei differenti effetti delle mutazioni di Ras, abbiamo usato cellule HT-29 (una linea cellulare di adenocarcinoma colorettale in cui i geni Ras sono wild-type) stabilmente trasfettate con i cDNA codificanti per K-RasG12V e K-RasG13D posti sotto il controllo di un promotore inducibile dall’ormone Mifepristone. Nel nostro laboratorio abbiamo trovato che l’espressione di queste due forme mutate di Ras causa differenti effetti sul tasso di crescita cellulare. Saggi di citofluorimetria hanno mostrato anche un differente effetto sul ciclo cellulare e che l’espressione di K-RasG13D ma non di K-RasG12V causa la morte cellulare per apoptosi o per necrosi. Entrambe le isoforme mutate di Ras incrementano l’espressione dell’inibitore del ciclo cellulare p21Waf-1/Cip-1. Infine, il trattamento di entrambi i cloni con l’inibitore delle chinasi MEK1/2, il PD98059, e/o con l’inibitore della PI3K, l’LY294002, aumenta l’espressione della proteina p21Waf-1/Cip-1, altera la proliferazione cellulare e la distribuzione delle cellule nelle tre fasi del ciclo cellulare.